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合成多肽一级结构分析鉴定方法

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多肽的分析鉴定方法有多肽一级结构,二级结构鉴定,多肽一级结构包括:质谱分析,氨基酸组成分析,氨基酸序列分析。二级结构包括:圆二色谱(CD),NMR,X-衍射等方法。下面就让小编为你介绍一下合成多肽一级分析鉴定方法。


合成多肽一级结构分析鉴定:

氨基酸序列分析

Edman降解为氨基酸序列分析的基本原理。耦联、水解、萃取和转换为其主要涉及的4个过程。在pH9.0的碱性条件下,使用苯异硫氰酸酯(PITC)处理蛋白质或多肽。PITC与肽链的N-端的氨基酸残基反应,使得苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物形成,即PTC-肽。之后使用三氟乙酸对PTC-肽进行处理,有选择地切断N-端氨基酸残基肽键,将该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物释放出来。接下来从反应液中萃取出该衍生物用有机溶剂(例如氯丁烷)而在溶液中依然留有去掉了一个N-端氨基酸残基。萃取出来的噻唑啉酮苯胺衍生物稳定性不高,通过酸的作用,进一步环化,从而使得一个稳定的苯乙内酰硫脲(PTH)衍生物形成,即PTH-氨基酸。留在溶液中的减少了一个氨基酸残基的肽再对上述反应过程重复的进行,通过测序仪自动进行整个测序过程。


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氨基酸组成分析

通常,需要纯度较高的产品,才能达到氨基酸组成分析的要求,它能够将多肽中氨基酸的种类,数目给出。

在分析的过程中,首先利用酸将肽键水解破坏掉。在真空条件下,110摄氏度下,使用盐酸水解16-72h。尽管酸水很有用,然而在酸水解条件下获得的氨基酸分析不是完整的。是由于天冬酰胺和谷氨酰胺的侧链含有酰胺键,天冬酰胺能够通过用于切断蛋白质肽键的酸转换为天冬氨酸,谷氨酰胺转换为谷氨酸。因为水解具有较高的温度,空气能够很容易将色氨酸的吲哚环氧化,就算在密封的管中,也基本会破坏色氨酸的吲哚环。所以,通常会通过蛋白质的紫外吸收光谱来对蛋白质的色氨酸含量进行估计。色氨酸的含量也能够通过碱水解来进行分析分析。在酸水解中也不能对半胱氨酸进行精确测定,只有在蛋白质水解之前进行氧化或羧甲基化,使得在酸水解之后形成的衍生物可以定量,才能够精确地测量。


质谱分析

对分子量进行确证为质谱分析的主要目的,当然,采用MS/MS能够对多肽序列的信息进行部分的了解,然而这个需要基于比较全的数据库,进行分析才会比较准确。

因为多肽具有不稳定的性质,需要采用软电离技术,目前为止基质辅助激光解吸(MALDI-MS)以及电喷雾(ESI-MS)为多肽分析主要使用的仪器。当中,多电荷峰一般会由ESI-MS给出,多肽序列上氨基,胍基,咪唑基的数目会影响电荷数目,所以,常常会有双电荷,三电荷等离子峰给出。

MALDI-MS能够对蛋白大分子进行分析,并且在一般的情况下,多电荷很少带,所以数据和分子离子峰直接对应,分析比较容易。除此以外,一般在对长肽或蛋白进行分析的过程中,需要将NH4,Na,K等离子加入,以便使灵敏度提高,因此,通常会有一组峰在MS中出现,分别对应:(M+H)+,(M+NH4)+,(M+Na)+,(M+K)+。


2019-07-30 17:37:21 浏览次数:57次
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