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蛋白质印迹法电泳准备

蛋白质印迹法(免疫印迹试验)就是Western Blot。作为一种实验方法。它常被用于分子生物学、生物化学和免疫遗传学中。生物组织样品或者凝胶电泳处理过的细胞经过特异性抗体着色,通过对着色的位置和着色深度的分析来使特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息获得。


电泳前准备工作

1、玻璃板的清洗

使用一只手将玻璃板扣紧,使用另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。在擦洗过两面之后,使用自来水冲,再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。


2、灌胶与上样

(1)对齐玻璃板后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。


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(2)将10%分离胶配制出来,将TEMED加入之后,马上摇匀,就能够灌胶。灌胶时,能够沿玻璃放出用10ml枪吸取的5ml胶。等到胶面一直升到绿带中间线高度为止,之后将一层水加在胶上,液封后的胶能够更加迅速地凝固。


(3)当胶已经凝固的时候,会有一条折射线出现在水和胶之间。再等3分钟,胶凝固充分,可以将胶上层水倒掉,并且使用吸水纸吸干水。


(4)将4%的浓缩胶配制而成,将TEMED加入以后,马上摇匀就能够灌胶。将浓缩胶灌入并且使之充满剩余空间,在浓缩胶中插入梳子。为了防止胶中产生气泡,灌胶时要沿玻璃板使胶流下。在将梳子插入时,要保持梳子水平。之所以会经常在浓缩胶凝固的过程中两边补胶,是因为胶凝固时会收缩,从而减小了体积,从而减小了加样孔的上样体积。等到浓缩胶凝固之后,拔出梳子。


(5)将浓缩胶用水冲洗一下,然后往电泳槽中放入。


(6)蛋白含量检测结束之后,将上样量也就是含50ng蛋白的溶液体积计算出来。在0。5ml离心管中加入取出的上样样品,将5×SDS上样缓冲液加入直到终浓度为1×,为了使蛋白变性,上样前要在沸水中将样品煮5min。


(7)将足够的电泳液加入之后,准备开始上样。用微量进样器贴壁将样品吸出。在加样孔中插入加样器针头将样品缓慢加入。在将下一个样品加入的时候,为了防止交叉污染,需要在外槽电泳缓冲液中对进样器洗涤3次。


2019-08-29 17:39:53 浏览次数:111次

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